Смотрите также

Журнал Глаукома 2003, №4

Медико-биологические исследования дренажа для лечения тяжелых форм глаукомы

Глаукома 4'2003

Н.В. Перова, И.А. Довжик, В.И. Севастьянов, А.М. Бессмертный¹, В.П. Еричев¹, О.В. Робустова¹

Научно-исследовательский институт трансплантации и искусственных органов, Москва;
¹Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца

При тяжелых формах глаукомы (неоваскулярной, увеальной, первичной неоднократно оперированной), когда традиционные фистулизирующие вмешательства не позволяют добиться стойкой нормализации внутриглазного давления (ВГД), все большее распространение получают антиглаукоматозные операции с использованием дренажей [1, 7].

Условно дренажи можно разделить на два типа: простые в виде трубочек или лент (бесклапанные) и сложные (как правило, имеющие клапан), состоящие из трубочки и пластины (дренажи Molteno, Baerveldt, Ahmed). Одним из самых существенных недостатков простых дренажей является снижение гипотензивного эффекта при обтурации конца имплантированной трубки. Кроме того, отсутствие клапана в простом дренаже для регулирования оттока камерной влаги может приводить к развитию противоположного отрицательного эффекта - к неконтролируемой гипотонии. Оба этих недостатка существенно уменьшают срок надежного функционирования простых дренажей.

В связи с этим нами предпринята попытка разработать новый дренаж с учетом основных требований, которые могут предъявляться к подобным конструкциям.

Цель работы - исследование биосовместимости нового дренажа в эксперименте.

Материал и методы

Для увеличения времени функционирования дренажа и сохранения контролируемого гипотензивного эффекта антиглаукоматозной операции нами была предложена принципиально новая конструкция изделия [9]. Дренаж представляет собой конструкцию, состоящую из двух компонентов - корпуса из гидрогеля с содержанием воды 70-76% и вставленных в корпус микротрубочек (рис. 1). При выполнении антиглаукоматозной операции дренаж фиксируется интрасклерально. Гипотензивная функция дренажа основывается на его способности поддерживать гидростатическое давление в замкнутой системе. Микротрубочки обеспечивают отток жидкости из передней камеры, а корпус дренажа выполняет функцию клапана. При повышении ВГД он начинает пропускать влагу за счет ограниченной сорбционной емкости гидрогеля.

Рис. 1. Общий вид дренажа. 1 - микротрубочки, 2 - корпус дренажа.

Одним из основных медико-биологических требований к имплантату является сохранение им биосовместимых свойств в течение всего времени функционирования. Поэтому несмотря на то, что все материалы, используемые в дренаже, уже давно применяются в клинической практике, доклинические исследования изделия являются обязательной стадией. Кроме того, биосовместимость дренажа зависит не только от свойств входящих в его состав материалов и условий функционирования, но и от конструкции и технологии изготовления изделия [8]. Так, например, риск применения нового дренажа может быть вызван экстрагируемыми низкомолекулярными веществами, образующимися на стадии изготовления изделия, и условиями его функционирования.

В качестве объекта испытания были взяты пилотные образцы антиглаукоматозного дренажа, изготовленные в ЗАО "Биомир-сервис" (Москва). Микротрубочки выполнены из полипропилена с внутренним диаметром 200 мкм, толщиной стенки 25 мкм, наружным диаметром 250 мкм и диаметром пор 0,02-0,04 мкм (фирма ALZO, Германия). Корпус дренажа изготовлен из микропористого сополимера гидроксиэтилметакрилата и тридексаэтиленгликольдиметилкрилата (ТГМ-13) - 26% с фиксированным содержанием воды (74%). Длина изделия - 4,0 мм; высота изделия - 0,6 мм; ширина - 2,0 мм. В стендовых испытаниях было показано, что устройство обеспечивает уровень ВГД не выше 24 и не ниже 12 мм рт.ст.

Для оценки биологического действия дренажа были привлечены следующие национальные стандарты испытаний медицинских изделий: ГОСТ Р ИСО 10993-99 "Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий": часть 5 "Исследование цитотоксичности", часть 6 "Исследование местного действия после имплантации", часть 4 "Исследование изделий, взаимодействующих с кровью", часть 13 "Идентификация и количественное определение продуктов деструкции полимерных медицинских изделий" [3-6].

Цитотоксичность была проверена на клеточной культуре фибробластов мышей линии 3Т3 клона SC-1. Готовили по три пробы на каждый образец. В качестве экстрагирующих сред (экстрактантов) использовали стерильные 0,9% раствор натрия хлорида и среду Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Соотношение площади поверхности образцов к объему экстрактанта - 3:1. Отрицательным контролем служила среда Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, положительным контролем - экстракт из низкомолекулярного силикона.

Клетки фибробластов высевали в стерильные пластиковые чашки Петри в концентрации 40 тыс./мл, инкубировали сутки при 37°С. Затем вносили каждый испытываемый экстракт на монослой фибробластов.

Через 24 ч инкубации при той же температуре оценивали лизис клеток, их морфологию и число. Сравнивали с положительным и отрицательным контролем, при этом количественным критерием метода являлась степень реакции клеток по 5 балльной шкале, где 0-я степень соответствует отсутствию реакции, а 5-я степень - высокой степени токсичности [4].

Экспериментальное исследование местного действия дренажа на живую ткань на макро- и микроскопическом уровнях проводили на кроликах породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг (всего 5 животных). Имплантировали образцы дренажей в слои склеры, выполняя разрез конъюнктивы и склеры в 3 мм от лимба (на 12 ч). Затем с помощью расслаивателя формировали "карман" в толще склеры с проникновением в переднюю камеру и помещали дренаж. Последовательно накладывали швы на склеру и конъюнктиву. Контролем служил левый глаз того же животного, на котором проводили все манипуляции, за исключением имплантации дренажа (ложнооперированный глаз).

Гемосовместимость материалов дренажей оценивали по изменению гемолитической активности комплемента сыворотки крови человека после ее инкубации с исследуемым образцом [2, 11].

Инкубацию в разбавленной веронал-мединаловым буфером сывороткой крови человека образцов дренажа проводили в специальных кюветах объемом 1 мл без доступа воздуха. Гемолитическую активность комплемента определяли добавлением 100 мкл исследуемой разбавленной сыворотки к 5 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов барана. Для обеспечения постоянной температуры (37°С) и кинетического режима реакции использовали термостатические ячейки с мешалкой. Оптическую плотность рабочих растворов (степень гемолиза) определяли на спектрофотометре Cecil CE 5502 (Англия) при длине волны 540 нм.

Количественными критериями метода являлись: константа скорости индуцированной активации системы комплемента (kинд, см-2 сек-1) и относительная (по купрофану) константа скорости индуцированной активации системы комплемента (kотнинд):

где (t_1/2)^обр, (t_1/2)^к - время полулизиса эритроцитов барана комплементом сыворотки после инкубации с образцом (обр) и без образца (к);

S - площадь поверхности образца, см²;

t - время инкубации;

K^обр_инд, K^станд._инд - константы скорости индуцированной активации системы комплемента образца и стандарта соответственно.

В качестве стандарта использовали широко используемую в клинической практике гидратцеллюлозную мембрану купрофан (Enka, Германия). Относительная ошибка метода 5-7% при надежности 0,95.

Деструкцию материалов, входящих в состав дренажа, исследовали после инкубации образцов в модельных средах, имитирующих физиологические условия.

Учитывая то, что данное изделие относится к категории постоянного контакта с тканями организма, время исследования при ускоренном изучении деструкции составило 60 суток. Выбранная температура инкубации (70+1°С) не превышала температуру плавления или размягчения полимера. Более высокие температуры могут приводить к побочным деструктивным реакциям, которые не протекают при физиологических условиях.

В качестве модельных сред, рекомендованных международным стандартом ИСО, были выбраны:

• бидистиллированная вода (рН = 6,5);
• раствор фосфатного буфера (рН =7,4);
• реактив Фентона - раствор сильно разбавленной перекиси водорода (Н₂О₂) и соли двухвалентного железа (FeSO₄ x 7H₂O) в соотношении 100 мкМ Fe²⁺ на 1мМ Н₂О₂, моделирующий условия воспалительного процесса при контакте материала с кровью.

Было исследовано девять проб - 3 серии (по количеству модельных сред), в каждой по 3 пробы.

Перед исследованиями образцы высушивали до постоянной массы и определяли их первоначальный вес. Отношение массы образца к объему раствора для проведения исследования составлял 1:10. После инкубации проводили разделение образцов и раствора и вновь высушивали образцы до постоянной массы.

Регистрируемые параметры были: масса образца (весы Sartorius 2442, Германия), рН инкубационной среды (рН-метр MP220 фирмы Metler-Toledo, Швеция) и ее спектр поглощения в УФ-области от 200 до 360 нм (спектрофотометр LKB-U1traspec, LKB, Швеция).

Количественным параметром, характеризующим скорость биодеградации, служило относительное значение потери массы (D m), вычисляемое по формуле:

D m = (m0 - mt)/m0 х 100%,

где m0 - исходная масса образца;

mt - масса образца после инкубации.

Кроме того, по изменению значений рН (DрН) и изменению оптической плотности среды (DDэкстракта) после инкубации образца оценивали возможную токсичность продуктов деструкции материалов, входящих в состав дренажа, например, наличие вышедших в экстракт непредельных соединений [6].

Соответствующие количественные параметры вычисляли по следующим формулам:

D D = Dэкстракта - Dконтр.,

где Dэкстракта - оптическая плотность среды после инкубации образца;

Dконтр. - оптическая плотность контрольной среды.

Контролем служила та или иная модельная среда (вода, буферный раствор, реактив Фентона), инкубируемая без образца. Допустимое значение изменения Dэкстракта для офтальмологических имплантатов - 0,15.

DрН = рН экстракта - рН контр,

где рН экстракта - значение рН экстрактанта после инкубации образца;

рН контр - значение рН экстрактанта (для каждой серии соответственно вода, буферный раствор, реактив Фентона), рН - ± 0,2.

Результаты и обсуждение

Степень цитотоксичности по ответной реакции клеточной культуры фибробластов линии 3Т3 после внесения проб приведена в табл. 1. Добавление в культуру клеток низкомолекулярного силикона вызывает их массовую гибель, что соответствует высокой степени токсичности экстракта (5 баллов) по 5 балльной шкале [4].

При нанесении на монослой фибробластов экстракта дренажа реакция фибробластов идентична для отрицательного контроля - пробе среды Игла. В обоих случаях не было выявлено гибели клеток и их морфологических изменений. Полученные результаты in vitro свидетельствуют о том, что экстракт дренажа не обладает цитотоксическими свойствами.

Таблица 1 Результаты цитотоксичности дренажей в условиях in vitro

Микроскопическое и гистологическое исследования тканей, окружающих дренаж после его имплантации в слои склеры кролика, показало, что воспалительная реакция соответствовала тяжести операционной травмы и завершалась к 5-му дню наблюдения. Течение воспалительной реакции при внутрисклеральной имплантации дренажа сопоставимо с наблюдаемой воспалительной реакцией на ложнооперированном глазу.

Рис. 2. Гистологическая картина места имплантации дренажа в слои склеры. Срок - 3 недели: 1 - фрагмент тонкой капсулы, образовавшейся вокруг тела дренажа, 2 - угол передней камеры.

Вокруг имплантата образовывалась тонкая соединительно-тканная капсула, которая была сформирована к концу 3-й недели (рис. 2). Дренаж сохранял свои функциональные свойства в течение всего периода наблюдения (сроком до 6 мес.).

Относительная (по купрофану) константа скорости активации системы комплемента in vitro для ПЭНП (0,76*0,06) в пределах ошибки метода соответствовала среднему значению Кинд для данного материала (табл. 2).

Таблица 2 Значения абсолютной (Kинд)обр и относительной (Кинд ) констант скоростей активации системы комплемента

Активация системы комплемента поверхностью дренажа в единицах Кинд не выходит за рамки порогового значения этой величины, равной 1,50*0,20, что свидетельствует о биосовместимости изделия на стадии гуморального иммунного ответа организма человека [2, 3, 11].

В табл. 3 представлены результаты измерений потери массы образцов в модельных средах при 70⁰С в течение 60 суток.

По результатам измерений отмечено незначительное уменьшение массы образцов в течение 60 суток при 70⁰С. Среднее значение Dm по всем модельным средам составляет 3,6±2.1%. Учитывая биостабильность полипропилена, следует отметить, что в условиях эксперимента ускоренных испытаний потеря массы дренажа обусловлена исключительно гидролитической деструкцией гидрогельного сополимера [10].

Таблица 4 Значения показателей рН и D_{экстракта} после инкубации образцов дренажа в модельных средах (70⁰С, 60 сут.)

Как следует из табл. 4, изменения значений рН и Dэкстракт для всех модельных сред соответствуют допустимым значениям, предъявляемым стандартом ГОСТ [4], что свидетельствует о нетоксичности экстрагируемых низкомолекулярных продуктов деструкции дренажа, образующихся в условиях ускоренного старения изделия. Это дает основание сделать предположение о сохранении биосовместимых свойств дренажа новой конструкции в течение всего периода его функционирования.

Таким образом, результаты проведенных доклинических исследований биосовместимых и функциональных свойств пилотных образцов антиглаукомного дренажа по цитотоксичности, гемолизу, активации комплемента, нетоксичности продуктов биодеградации и моделированию антиглаукоматозной операции на кролике дают основание надеяться на положительные результаты его клинических испытаний.

Литература

1. Бессмертный А.М., Червяков А.Ю. Применение имплантов в лечении рефрактерной глаукомы // Глаукома.? 2001.? № 1.? С. 44-47.
2. Доброва Н.Б., Носкова Т.И., Новикова С.П., Севастьянов В.И. Сборник методических рекомендаций по оценке биосовместимых свойств искусственных материалов, контактирующих с кровью.- М.: ВНИИПрибор, 1991.
3. ГОСТ Р ИСО 10993.99. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. "Исследование изделий, взаимодействующих с кровью". Госстандарт России- М., 1999.
4. ГОСТ Р ИСО 10993.99. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5 "Исследование на цитотоксичность: методы in vitro". Госстандарт России- М., 1999.
5. ГОСТ Р ИСО 10993.99 Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6 "Исследование местного действия после имплантации". Госстандарт России- М., 1999.
6. ГОСТ Р ИСО 10993. 99. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 13. "Идентификация и количественное определение продуктов деструкции полимерных медицинских изделий". Госстандарт России- М., 1999.
7. Плате Н.А., Валуев Л.И., Синани В.А. и др. Дренаж для лечения глаукомы. Авторское свидетельство СССР №1312768. Дата публикации: 1988.01.10.
8. Севастьянов В.И. Биосовместимость.- М.: ИЦ ВНИИГС, 1999.- 367 с.
9. Севастьянов В.И., Бессмертный А.М., Еричев В.П., Перова Н.В., Довжик И.А. Дренаж для лечения глаукомы. Патент РФ № 2192821 с приоритетом от 20.11.02.
10. Шефтель В.О. Полимерные материалы (токсические свойства). Справочник.- Л., 1982.
11. Sevastianov V.I., Tseytlina E.A. The activation of the complement system by polymer materials and their blood compatibility // J. Biomed. Mater. Res.- 1984.- Vol. 18.- P. 969-978.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Общий вид дренажа: 1 - микротрубочки, 2 - корпус дренажа

Рис. 2. Гистологическая картина места имплантации дренажа в слои склеры. Срок - 3 недели: 1 - фрагмент тонкой капсулы, образовавшейся вокруг тела дренажа, 2 - угол передней камеры

Results of biomedical investigation of drainage for surgical treatment of glaucoma

N.V. Perova, I.A. Dovzhik, V.I. Sevastianov, А.M. Bessmertny, V.P. Erichev, O.V. Robustova

The paper presents the data of biomedical investigation of drainage with new construction for long-time supporting of hydraulic pressure in closed system. The drainage was made from micropores methacrylic copolymer and hollow polypropylene fibers. The results of sanitary-chemical, toxicological and immunological investigations of drainage obtained in accordance with National Standards GOST R ISO 10993-99 in vitro and in vivo show that the samples all feature the properties making them suitable for medical application. Moreover the drainage performed its functional properties during all period of observation (up to 6 months) in the rabbit's model experiments.

Комментарии пользователей

^{25 октября 2006 года, 16:31}

Чтобы прокомментировать статью, войдите в систему или зарегистрируйтесь!